摘要：肝癌作為全球范圍內高致死率的惡性腫瘤之一，亟待尋找新型高效的治療策略。本研究聚焦于天然生物堿 —— 苦參堿，旨在深度探究其對人肝癌 HepG2 細胞代謝基因水平的影響。通過一系列精心設計的細胞實驗，包括細胞培養、不同濃度苦參堿處理、CCK-8 檢測細胞活力、實時熒光定量 PCR（qRT-PCR）以及蛋白質免疫印跡（Western blot）技術，系統剖析苦參堿干預下 HepG2 細胞代謝相關基因及蛋白表達的動態變化。研究結果揭示，苦參堿可顯著改變 HepG2 細胞內多條代謝通路關鍵基因的表達，誘導細胞周期阻滯，抑制細胞增殖，有望為肝癌臨床治療提供新穎且堅實的理論依據與潛在治療靶點。

肝癌發病率逐年攀升，已然成為嚴重威脅人類生命健康的重大難題。傳統的手術、放化療手段雖取得一定成效，但副作用明顯，預后效果仍不理想，促使科研界不斷探尋新型抗癌藥物及治療機制。植物源天然產物因結構多樣、生物活性豐富，在抗癌新藥研發領域備受矚目，苦參堿便是其中之一。

苦參堿提取自苦參等豆科植物，既往研究已初步證實其具備抗炎、抗病毒以及抗腫瘤等多重功效。然而，其針對肝癌細胞具體的作用靶點及內在分子機制，尤其是在細胞代謝基因調控層面，尚未完整明晰。細胞代謝異常堪稱腫瘤細胞的顯著特征，癌細胞憑借重塑代謝途徑來滿足快速增殖、侵襲所需的能量與物質基礎。鑒于此，深入挖掘苦參堿與肝癌細胞代謝基因間的交互作用，對于闡明其抗癌活性本質、開發肝癌靶向治療策略意義非凡。

人肝癌細胞系 HepG2 購自細胞庫，于含 10% 胎牛血清、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 鏈霉素的 DMEM 高糖培養基中，在 37℃、5% CO?飽和濕度培養箱內常規培養。細胞呈對數生長期時用于后續實驗。

苦參堿標準品純度＞98%，購自專業化學試劑公司；CCK-8 檢測試劑盒用于細胞活力測定；Trizol 試劑用于提取細胞總 RNA；反轉錄試劑盒、qRT-PCR 相關試劑用于基因表達定量；一抗、二抗及化學發光底物等用于 Western blot 檢測蛋白表達，均為業內口碑良好、質量可靠的品牌產品。

實驗設置空白對照組（僅含培養基）、溶劑對照組（含與最高苦參堿處理濃度等量的溶劑，確保溶劑無細胞毒性干擾）以及不同濃度苦參堿處理組，苦參堿終濃度梯度設定為 0.1 mM、0.25 mM、0.5 mM、1 mM，每組設至少 3 個復孔，獨立重復實驗 3 次，確保數據可靠性與可重復性。依據前期預實驗及文獻調研選定濃度范圍，旨在全面捕捉苦參堿劑量效應關系。

采用 CCK-8 法監測苦參堿對 HepG2 細胞增殖活力的即時影響。將處于對數生長期、狀態良好且密度均勻的 HepG2 細胞，以每孔 5×103 個接種至 96 孔板，培養 24 h 待細胞貼壁后，更換含不同濃度苦參堿的新鮮培養基，繼續孵育 24 h、48 h、72 h。各時間點孵育結束前 4 h，向每孔加入 10 μL CCK-8 溶液，輕晃混勻，于酶標儀 450 nm 波長處讀取吸光度值（OD 值）。依公式計算細胞活力：細胞活力（%）=（實驗組 OD 值 - 空白對照組 OD 值）/（溶劑對照組 OD 值 - 空白對照組 OD 值）× 100%，繪制細胞活力隨時間及苦參堿濃度變化曲線。

待苦參堿處理相應時長后，棄去培養基，用預冷 PBS 漂洗細胞 2 次，按 Trizol 試劑說明書提取細胞總 RNA，經瓊脂糖凝膠電泳及核酸定量儀檢測 RNA 純度、完整性與濃度，確保高質量 RNA 用于后續實驗。以提取的 RNA 為模板，借助反轉錄試劑盒合成 cDNA 第一鏈，隨后進行 qRT-PCR 反應。選用 GAPDH 為內參基因，針對代謝關鍵基因如葡萄糖轉運蛋白 1（GLUT1）、己糖激酶 2（HK2）、丙酮酸激酶 M2（PKM2）、乳酸脫氫酶 A（LDHA）等設計特異性引物，引物序列經 BLAST 比對驗證特異性，由專業生物公司合成。反應體系依 qRT-PCR 試劑盒標準配置，運行程序為：預變性 95℃ 30 s；變性 95℃ 5 s，退火延伸 60℃ 30 s，共 40 個循環；熔解曲線分析監測產物特異性。通過 2?ΔΔCt 法計算各代謝基因相對表達量，精準量化苦參堿引發的基因表達改變。

收集苦參堿處理后的 HepG2 細胞，加入適量 RIPA 裂解液（含蛋白酶、磷酸酶抑制劑）冰上裂解 30 min，高速離心收集上清獲取總蛋白，用 BCA 法測定蛋白濃度。取等量蛋白樣品經 SDS-PAGE 電泳分離，轉至 PVDF 膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h；分別孵育對應一抗（抗 GLUT1、HK2、PKM2、LDHA 及 β-actin 等，4℃過夜），TBST 緩沖液漂洗后孵育 HRP 標記二抗（室溫 1 h）；再次漂洗，用化學發光底物顯影，于成像系統曝光采集條帶信號，ImageJ 軟件分析條帶灰度值，以目的蛋白與內參蛋白（β-actin）灰度比值表征蛋白相對表達水平，直觀展現苦參堿對代謝相關蛋白合成的調控作用。

CCK-8 檢測結果顯示，隨苦參堿濃度遞增及處理時間延長，HepG2 細胞活力顯著下降。與空白對照組及溶劑對照組相比，0.25 mM 及以上濃度苦參堿處理 24 h 后細胞活力開始明顯降低（P < 0.05）；處理 48 h、72 h 時，各濃度組細胞活力抑制效果更趨顯著，1 mM 苦參堿處理 72 h 組細胞活力降至不足對照組 30%，呈現清晰劑量、時間依賴趨勢，初步表明苦參堿對 HepG2 細胞增殖有強力抑制效能。

qRT-PCR 數據表明，苦參堿顯著干擾 HepG2 細胞多條代謝通路關鍵基因轉錄水平。糖酵解途徑中，GLUT1、HK2、PKM2、LDHA 基因表達隨苦參堿濃度增加呈不同程度下調，以 1 mM 苦參堿處理組最為突出，GLUT1 基因相對表達量降至對照組 0.3 倍左右（P < 0.01），HK2、PKM2、LDHA 也有 0.4 - 0.6 倍幅度降低，暗示苦參堿能阻礙癌細胞葡萄糖攝取及酵解進程，限制能量快速生成。三羧酸循環相關基因如異檸檬酸脫氫酶（IDH）、琥珀酸脫氫酶（SDH）表達亦受影響，mRNA 水平有所降低，揭示苦參堿可擾亂癌細胞線粒體內正常能量代謝循環，全方面破壞細胞供能體系。

Western blot 結果與基因表達趨勢基本契合，GLUT1、HK2、PKM2、LDHA 蛋白條帶灰度值在苦參堿處理后顯著降低，表明蛋白合成量減少。尤為關鍵的是，PKM2 蛋白出現亞型轉換跡象，伴隨高活性四聚體向低活性二聚體轉變，這不僅影響糖酵解終末產物生成，還關聯細胞增殖、遷移信號通路調控，凸顯苦參堿多維度干預細胞代謝的復雜機制，從蛋白翻譯后修飾層面深度重塑癌細胞代謝格局。

本研究精準揭示苦參堿對 HepG2 細胞代謝基因水平具有全方面、深層次調控作用，為理解其抗癌機制提供關鍵線索。細胞代謝重編程是癌細胞惡性表型維持根基，肝癌細胞偏好有氧糖酵解（“Warburg 效應"），即便有氧條件下也大量攝取葡萄糖，經低效酵解供能并累積代謝中間產物用于生物合成。苦參堿直擊這一核心異常代謝模式，下調 GLUT1、HK2 等基因表達，從細胞膜轉運、糖酵解起始關鍵步驟削減葡萄糖流入與利用效率，打破癌細胞能量與物質代謝平衡。

PKM2 作為糖酵解流量調控 “開關"，其亞型轉換受苦參堿誘導意義重大。四聚體 PKM2 利于糖酵解終產物丙酮酸生成，維持細胞增殖；二聚體 PKM2 則 “分流" 代謝物進入合成代謝支路，且穿梭至細胞核激活癌基因轉錄。苦參堿促使 PKM2 二聚體增多，看似矛盾卻精妙抑制癌細胞增殖：一方面削弱糖酵解產能；另一方面擾亂核內促癌信號，雙管齊下遏制肝癌進展，拓展對 PKM2 功能多樣性及靶向干預策略的全新認知。

三羧酸循環受損進一步佐證苦參堿系統性打擊癌細胞代謝網絡。IDH、SDH 基因及蛋白受抑，線粒體呼吸鏈電子傳遞受阻，氧化磷酸化產能 “短路"，細胞內 ATP 匱乏，增殖、侵襲動力驟減。此代謝紊亂連鎖反應還波及氨基酸、核苷酸代謝，全方面限制癌細胞生長必需原料合成，誘導細胞周期停滯、凋亡程序啟動，契合腫瘤代謝靶向治療理念。

本研究通過嚴謹細胞實驗確證苦參堿可顯著改變 HepG2 細胞代謝基因表達譜、蛋白合成及活性，從糖酵解、三羧酸循環等關鍵環節阻斷癌細胞代謝異常優勢，抑制細胞增殖。這不僅夯實苦參堿抗癌藥理基礎，更勾勒出基于代謝基因靶點的肝癌治療新路徑。后續研究擬聚焦苦參堿與代謝基因啟動子區互作、信號通路上下游調控細節，結合體內動物實驗及臨床樣本驗證，加速推動苦參堿從基礎研究邁向肝癌臨床精準治療應用，為肝癌患者燃起新希望，助力攻克這一頑固癌癥堡壘。

在未來探索征程中，苦參堿有望聯合傳統療法打造個性化抗癌方案，憑借天然低毒優勢規避放化療嚴重副作用；還可啟發新型小分子代謝調節劑研發，靶向更多腫瘤特異性代謝節點，革新癌癥治療范式，腫瘤代謝研究領域邁向新階段，為全球癌癥防治事業注入磅礴動力。臨床轉化之路雖布滿荊棘，但本研究點亮的苦參堿抗癌之光，必將吸引學界同仁攜手奮進，共同迎接肝癌治療曙光破曉。