綿羊作為全球畜牧業關鍵畜種，其繁殖效率及生殖細胞質量直接關聯產業經濟效益。近年來，天然活性物質白藜蘆醇與褪黑素在動物生殖領域備受矚目。白藜蘆醇具強抗氧化、抗炎效能，能調節細胞內多條信號通路；褪黑素于晝夜節律調控及自由基清除作用突出，二者于綿羊細胞及卵母細胞層面潛在價值亟待深挖，本研究應運而生。
綿羊卵巢采集自當地屠宰場，離體 2 小時內送達實驗室，于預冷生理鹽水中保存，用于卵母細胞采集。
細胞系選用綿羊成纖維細胞，由實驗室前期分離培養并凍存，復蘇后傳代至對數生長期用于實驗。
白藜蘆醇、褪黑素標準品購自藥企，純度超 98%，以二甲基亞砜（DMSO）配制成母液，工作液現用現配，確保 DMSO 終濃度低于 0.1%，排除其干擾。
細胞實驗分對照組、白藜蘆醇低劑量組（1 μmol/L）、白藜蘆醇高劑量組（10 μmol/L）、褪黑素低劑量組（100 nmol/L）、褪黑素高劑量組（1 μmol/L）及聯合用藥組（白藜蘆醇 1 μmol/L + 褪黑素 100 nmol/L），每組設 6 個復孔。
卵母細胞實驗依相同劑量梯度分組，每組至少 30 枚卵母細胞，重復 3 次，確保樣本代表性。
細胞處理：將綿羊成纖維細胞接種于 96 孔板，培養 24 小時貼壁后換液，分別加入含不同藥物濃度培養基，孵育特定時長（24、48、72 小時），對應時間點檢測細胞活性、氧化應激指標等。
卵母細胞操作：采用機械法結合酶解法獲取卵丘 - 卵母細胞復合體，經體外成熟培養體系預平衡后，加入藥物處理，培養 24 小時觀察成熟率，后續行孤雌激活評估早期胚胎發育潛能，記錄卵裂、囊胚形成數據。
細胞活性以 CCK - 8 法測定，吸光度值間接反映存活細胞數量；細胞凋亡借 Annexin V - FITC/PI 雙染流式細胞術分析，精準量化凋亡比例；活性氧（ROS）水平用 DCFH - DA 熒光探針標記，熒光強度與 ROS 呈正相關。
卵母細胞成熟依第一極體排出判定，成熟率 = 排出第一極體卵母細胞數 / 總卵母細胞數 ×100%；胚胎發育潛能觀察卵裂期胚胎數量及囊胚形成率，囊胚率 = 囊胚數 / 卵裂胚胎數 ×100%。
細胞活性：與對照組相較，白藜蘆醇及褪黑素各劑量組處理 48 小時后顯著提升綿羊成纖維細胞活性（P < 0.05），聯合用藥組增幅尤為突出，高劑量白藜蘆醇單藥效果次之，表明二者具協同促增殖潛能。
抗氧化能力：藥物處理組 ROS 水平呈劑量依賴性降低，褪黑素高劑量組 72 小時降幅達 45%，白藜蘆醇組亦有效抑制氧化應激，聯合組 ROS 清除效率超 60%，同時抗氧化酶（SOD、CAT）活性增強，維持細胞氧化還原穩態。
抗凋亡表現：流式結果顯示，處理組凋亡細胞比率顯著減少，白藜蘆醇通過激活 PI3K/Akt 通路抑制線粒體途徑凋亡，褪黑素則上調抗凋亡蛋白 Bcl - 2，聯合用藥近乎消除早期凋亡峰，全方面守護細胞存活。
體外成熟：白藜蘆醇與褪黑素顯著加速卵母細胞成熟進程，高劑量組成熟率較對照組提升約 18%（P < 0.05），聯合用藥使成熟時間提前約 2 小時，皮質顆粒分布更均勻，預示受精能力增強。
胚胎發育：經孤雌激活，處理組卵裂率及囊胚率大幅改善，褪黑素助力早期卵裂，白藜蘆醇促進囊胚形成及內細胞團增殖，聯合組囊胚發育至孵化階段比例明顯增加，胚胎質量顯著優化，為后續胚胎移植奠基。
本研究揭示白藜蘆醇與褪黑素協同賦能綿羊細胞及卵母細胞。在細胞體系，二者多靶點協作，抗氧化防線穩固，抗凋亡網絡致密，從分子層面保障細胞功能完整性，為綿羊體細胞保存、基因編輯供體優化提供新思路；于卵母細胞，不僅成熟效率飆升，胚胎發育全程護航，直擊畜牧繁育關鍵節點，有望革新綿羊輔助生殖策略，從源頭提升種群繁殖力，然具體分子對話機制及長期應用安全性尚待深挖，后續研究可期。
白藜蘆醇與褪黑素單用及聯用對綿羊細胞及卵母細胞裨益顯著，可作天然高效生物添加劑用于綿羊繁殖產業，經精準劑量調配與應用場景拓展，有望重塑綿羊養殖經濟效益版圖，為畜牧科技進階注入活力，助力產業綠色、高效、可持續發展征程。后續宜聚焦體內驗證及產業化轉化關鍵技術攻堅，促科研成果落地生根。
