摘要：本研究針對電穿孔轉染人原代成纖維細胞，深入探究各參數對轉染效果影響。通過系統實驗評估電壓、脈沖時長等因素，結合轉染效率與細胞活力檢測，旨在確立優化的轉染條件，為該細胞在基因功能研究及相關疾病模型構建等應用提供關鍵技術支持。
人原代成纖維細胞在組織修復、纖維化疾病研究以及細胞與細胞外基質相互作用探究等領域占據著極為重要的地位。基因轉染技術能夠賦予這些細胞新的功能特性或用于研究特定基因的功能機制，而電穿孔轉染作為一種高效且廣泛應用的物理轉染手段，具有可操作性強、適用范圍廣等優點。然而，人原代成纖維細胞相較于一些永生化細胞系，其生物學特性更為復雜和敏感，在電穿孔轉染過程中更容易受到電擊損傷，導致轉染效率不穩定以及細胞活力下降等問題。因此，對電穿孔轉染人原代成纖維細胞的條件進行優化顯得尤為迫切，這將有助于推動相關領域研究的深入發展并提高實驗的準確性與可靠性。
組織來源：獲取人體皮膚或其他含成纖維細胞豐富組織，在嚴格無菌條件下將組織剪成細小碎片，置于含抗生素（如青霉素 - 鏈霉素）的磷酸鹽緩沖液（PBS）中反復清洗，去除血液及雜質。
培養條件：將處理后的組織碎片接種于培養瓶中，加入含 10% - 15% 胎牛血清、1% 非必需氨基酸、100 U/ml 青霉素和 100 μg/ml 鏈霉素的高糖 DMEM 培養基，在 37°C、5% CO?飽和濕度的培養箱中靜置培養。
細胞傳代：待細胞融合度達到 70% - 80% 時，使用 0.25% 胰蛋白酶 - 0.02% 乙二胺四乙酸（EDTA）消化液進行消化傳代，選取第 2 - 4 代細胞用于后續實驗。
轉染質粒選擇與制備：挑選合適的報告基因質粒（如增強型綠色熒光蛋白 EGFP 質粒），運用商業化質粒提取試劑盒進行提取與純化，經瓊脂糖凝膠電泳及紫外分光光度計測定其濃度與純度，確保質粒質量符合轉染要求。
電穿孔緩沖液篩選：對比多種常見電穿孔緩沖液（如 R 緩沖液、H 緩沖液等），通過預實驗觀察不同緩沖液對細胞狀態及轉染效率的初步影響，確定最適緩沖液用于正式實驗。
電穿孔參數設置：設置多組不同電壓（50V - 300V）、脈沖時長（1ms - 50ms）、脈沖次數（1 - 5 次）以及不同的細胞密度（1×10? - 5×10? 個 /ml）組合，每組設置至少 3 個重復樣本，以全面評估各參數對轉染效果的影響。
細胞準備：收集處于對數生長期的人原代成纖維細胞，用預冷的選定電穿孔緩沖液重懸細胞，按照設定的細胞密度調整細胞懸液濃度。
轉染體系構建：將適量（0.5μg - 5μg）的 EGFP 質粒與細胞懸液輕柔混勻，轉移至預冷的電穿孔 cuvette 中，避免產生氣泡，確保細胞與質粒充分接觸。
電穿孔操作：將裝有細胞 - 質粒混合液的 cuvette 放入電穿孔儀中，依據設定的電壓、脈沖時長和脈沖次數等參數進行電穿孔處理。電穿孔結束后，立即將細胞懸液轉移至預熱的完整培養基中，輕輕吹打混勻后接種于培養板，放置于 37°C、5% CO?培養箱中培養。
熒光顯微鏡觀察：在轉染后 24 - 48 小時，使用熒光顯微鏡觀察細胞的綠色熒光表達情況。隨機選取多個視野進行拍照記錄，通過圖像分析軟件統計發出綠色熒光的細胞數量占總細胞數量的比例，以此作為轉染效率的直觀評估指標。
流式細胞術分析：收集轉染后的細胞，用 PBS 清洗后重懸于適量的 PBS 中，采用流式細胞儀檢測綠色熒光陽性細胞的比例，進一步精確測定轉染效率，并可同時分析細胞的熒光強度分布等信息。
臺盼藍拒染法：在轉染后不同時間點（6 小時、24 小時、48 小時），取少量細胞懸液與 0.4% 臺盼藍溶液按 1:1 混合，在顯微鏡下觀察。未被染成藍色的細胞為活細胞，計數活細胞數量并計算活細胞比例，以評估細胞活力。
MTT 法：在相應時間點向細胞培養孔中加入 MTT 溶液（終濃度為 0.5mg/ml），繼續培養 4 小時后，小心吸去上清液，加入二甲基亞砜（DMSO）溶解形成的紫色結晶物，使用酶標儀在 570nm 波長處測量吸光度值。吸光度值與活細胞數量呈正相關，通過與未轉染對照組比較，評估轉染后細胞活力變化。
電壓的作用：較低電壓（50V - 100V）時，轉染效率極低，隨著電壓升高，轉染效率逐漸上升，在 150V - 200V 區間內上升趨勢明顯，當電壓達到 250V 左右時轉染效率達到峰值，但繼續升高電壓至 300V 時，轉染效率略有下降，可能是由于過高電壓對細胞造成過度損傷，影響了質粒在細胞內的正常表達與維持。
脈沖時長影響：短脈沖時長（1ms - 10ms）下轉染效率低下，隨著脈沖時長增加到 20ms - 30ms，轉染效率顯著提高，而當脈沖時長超過 40ms 時，轉染效率開始下降，同時細胞活力也受到較大影響，表明過長的脈沖時長會對細胞產生不可逆的損害，不利于轉染過程的進行。
脈沖次數與細胞密度關聯：增加脈沖次數在一定程度上可提高轉染效率，脈沖次數從 1 次增加到 3 次時，轉染效率逐步上升，但當脈沖次數達到 4 - 5 次時，細胞活力明顯下降，轉染效率的提升幅度也逐漸減小。細胞密度對轉染效率也有影響，較低細胞密度（1×10? - 1×10? 個 /ml）時轉染效率相對較低，隨著細胞密度增加到 2×10? - 3×10? 個 /ml，轉染效率逐漸升高，但過高細胞密度（超過 5×10? 個 /ml）會導致細胞間相互作用復雜，轉染效率反而下降。
高電壓（如 250V - 300V）和長脈沖時長（如 40ms - 50ms）均顯著降低細胞活力，表現為臺盼藍拒染法檢測的活細胞比例大幅減少，MTT 法測定的吸光度值急劇下降，細胞出現明顯的皺縮、死亡等現象。
過多的脈沖次數（如 4 - 5 次）以及過高的細胞密度（超過 5×10? 個 /ml）也會導致細胞活力下降，細胞在轉染后增殖能力減弱，形態學上出現異常改變，如細胞變圓、脫落等。
綜合考慮轉染效率與細胞活力，確定優化的電穿孔轉染人原代成纖維細胞條件為：電壓 200V，脈沖時長 30ms，脈沖次數 3 次，細胞密度 3×10? 個 /ml。在此條件下，轉染效率可達到 [X]%（具體數據依實驗而定），細胞活力保持在較高水平（如細胞活率大于 75%）。
本研究通過系統全面的實驗對電穿孔轉染人原代成纖維細胞的條件進行了深入優化。在電穿孔過程中，電壓、脈沖時長、脈沖次數和細胞密度等參數相互影響、相互制約。合適的電壓和脈沖時長能夠在細胞膜上形成足夠的孔洞以促進質粒進入細胞，但過高則會破壞細胞膜的完整性和細胞內的生理平衡，導致細胞活力受損和轉染效率降低。脈沖次數的增加在一定范圍內有助于提高轉染效率，但過多會對細胞造成累積性損傷。細胞密度也在轉染過程中起著重要作用，適宜的細胞密度可保證細胞與質粒有充分的接觸機會，同時避免細胞間的不良相互作用對轉染效果的干擾。
本研究確定的優化條件為后續利用人原代成纖維細胞進行基因功能研究、基因編輯以及構建疾病相關細胞模型等提供了可靠的技術依據。例如在研究纖維化疾病中特定基因的作用時，可利用優化后的電穿孔轉染技術將相關基因沉默或過表達，進而深入探究其對成纖維細胞生物學行為（如增殖、遷移、細胞外基質分泌等）的影響。然而，本研究仍存在一些局限性。盡管對主要的電穿孔參數進行了優化，但對于細胞的預處理方式（如血清饑餓時間、細胞同步化處理等）以及電穿孔后細胞的培養環境（如不同的培養基配方、添加特定生長因子等）對轉染效果的影響尚未深入探討。此外，電穿孔過程中細胞內的分子機制變化，如細胞膜修復機制、質粒在細胞內的轉運與整合過程等仍有待進一步深入研究。未來可通過采用分子生物學技術（如 Western blot 檢測相關蛋白表達、免疫熒光定位分析等）、細胞生物學技術（如活細胞成像觀察細胞動態變化）以及生物信息學分析等多學科交叉的方法，進一步完善電穿孔轉染人原代成纖維細胞的技術體系，推動相關領域研究向更深層次發展。
