摘要：本研究聚焦構建人 HVEM 基因轉染細胞株對 T 細胞的促進作用。詳述實驗流程，涵蓋細胞株選取、HVEM 基因克隆、轉染方法、T 細胞共培養及功能檢測等環節，旨在揭示其免疫調節機制，為免疫治療開拓新路徑，提供關鍵技術支撐。

（1）免疫治療的前沿背景

當下，免疫治療在疾病攻克中嶄露頭角，尤其在腫瘤、自身免疫病等領域備受矚目。然而，現有免疫療法仍存在療效局限、免疫激活不充分等瓶頸，亟需挖掘新靶點與策略深化治療效果。

（2）HVEM 基因的潛在價值

人 HVEM 基因參與機體免疫調控網絡，其編碼蛋白與 T 細胞活化、增殖緊密相關。通過基因工程手段構建轉染細胞株，有望精準調控 HVEM 表達，撬動 T 細胞免疫潛能，為免疫治療注入新活力。

（1）實驗材料準備

收集多種細胞系（如 HEK293、Jurkat 等），篩選適合作為 HVEM 基因轉染宿主的細胞株，儲備人 HVEM 基因模板，配備高保真 PCR 試劑、轉染試劑（脂質體、電穿孔試劑等），以及用于 T 細胞分離、培養的相關耗材與試劑，還有檢測細胞功能的流式細胞儀等設備。

（2）人 HVEM 基因克隆實驗

基因擴增與純化：依據人 HVEM 基因序列設計特異性引物，利用 PCR 技術從 cDNA 文庫擴增目的基因片段，通過凝膠電泳、切膠回收純化擴增產物，確保基因完整性與純度。

載體構建：將純化后的 HVEM 基因片段與合適的表達載體（如 pcDNA3.1 等）連接，采用限制性內切酶酶切、連接酶連接等分子克隆手段，構建重組質粒，經測序驗證插入序列準確性。

（3）細胞轉染及穩定細胞株篩選實驗

轉染條件優化：分別采用脂質體轉染法與電穿孔轉染法，以不同參數（脂質體濃度、電穿孔電壓等）將重組質粒導入篩選出的宿主細胞，通過熒光報告基因監測轉染效率，優化最佳轉染條件。

穩定細胞株篩選：轉染后，利用含抗生素（如 G418）的培養基篩選，存活細胞經有限稀釋法單克隆化培養，經 PCR、Western blot 鑒定 HVEM 基因穩定整合與表達的單克隆細胞株。

（4）與 T 細胞共培養及功能檢測實驗

共培養體系建立：將構建的 HVEM 基因轉染細胞株與分離自外周血的 T 細胞按一定比例共培養，設置空白對照組（未轉染細胞與 T 細胞共培養）與陽性對照組（添加已知 T 細胞刺激劑共培養）。

T 細胞增殖檢測：培養一定時間后，采用 CCK - 8 法檢測 T 細胞增殖活性，繪制生長曲線，對比各組 T 細胞增殖速率，評估 HVEM 轉染細胞株對 T 細胞增殖的促進作用。

細胞因子分泌檢測：收集共培養上清，利用 ELISA 法檢測 IL - 2、IFN -γ 等 T 細胞相關細胞因子含量，分析 HVEM 基因對 T 細胞免疫功能活化的影響。

（1）HVEM 基因克隆與細胞株構建結果

成功擴增出人 HVEM 基因片段，測序無誤，構建的重組質粒轉染宿主細胞后，經篩選獲得穩定表達 HVEM 的細胞株，為后續研究奠定基石。

（2）轉染優化及穩定株鑒定結果

脂質體轉染在某特定濃度下、電穿孔在特定電壓時轉染效率高，篩選出的單克隆穩定株 HVEM 蛋白表達水平穩定，證明細胞株構建成功且具有一致性。

（3）共培養對 T 細胞功能影響結果

與 HVEM 基因轉染細胞株共培養的 T 細胞增殖活性顯著高于對照組，細胞因子分泌量增多，有力表明構建的細胞株能有效促進 T 細胞功能活化。

（1）HVEM 基因調控機制剖析

深入探究 HVEM 激活 T 細胞的信號通路，明確上下游分子交互節點，有助于精準調控免疫反應強度，為個性化免疫治療提供理論依據，避免過度免疫激活引發的副作用。

（2）轉染技術改進空間

現有轉染方法雖構建出穩定株，但存在細胞毒性、效率瓶頸。探索新型納米材料介導轉染或聯合物理轉染技術，有望進一步提升轉染成功率、降低細胞損傷，保障基因工程操作穩定性。

（3）臨床轉化前景展望

從基礎研究邁向臨床應用，需考量細胞株安全性、規模化制備及體內免疫微環境適配性。多中心臨床試驗、跨領域協作，將助力這一技術突破臨床轉化障礙，造福患者。

本研究系統構建人 HVEM 基因轉染細胞株并證實其對 T 細胞的促進功效，從基因克隆、細胞轉染到共培養功能驗證層層深入。為免疫治療解鎖新策略，積累關鍵數據，有望推動免疫調節技術革新，開啟精準免疫治療新征程。