摘要

本文研究了基于定向改造的釀酒酵母丙酮酸積累，通過基因敲除和發酵條件優化，顯著提高了釀酒酵母中丙酮酸的積累量。實驗結果顯示，優化后的釀酒酵母菌株丙酮酸積累量提高了168%，為丙酮酸的工業化生產提供了新的策略。

引言

丙酮酸是生物細胞內糖酵解途徑（EMP）中的關鍵中間產物，不僅在生物能量代謝中具有重要作用，而且是多種有用物質的前體，廣泛應用于化工、農藥、農用化學品及生物制藥等領域。目前，丙酮酸的生產主要依賴于微生物發酵，其中光滑球擬酵母（Torulopsis glabrata）是常用的生產菌株。然而，光滑球擬酵母是一種條件致病菌，存在潛在的安全威脅。相比之下，釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）作為一種的安全菌，在食品工業和酒精生產中有著廣泛應用，因此更適合作為丙酮酸的生產菌株。

釀酒酵母中的丙酮酸主要通過糖酵解途徑生成，并隨后進入乙醇發酵途徑被轉化為乙醇和二氧化碳。為了提高釀酒酵母中丙酮酸的積累量，需要阻斷乙醇生成途徑，使代謝流更多地流向丙酮酸。丙酮酸脫羧酶（PDC）是催化丙酮酸轉化為乙醛的關鍵酶，通過敲除PDC基因，可以阻斷乙醇生成途徑，從而提高丙酮酸的積累量。

本研究旨在通過定向改造釀酒酵母，敲除PDC基因，并通過發酵條件優化，提高丙酮酸的積累量。這不僅有助于解決光滑球擬酵母的安全性問題，還能為丙酮酸的工業化生產提供新的策略。

材料與方法

1. 實驗材料

• 菌株：釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae Y2

• 試劑：某試劑G418、某試劑醋酸鋰、某試劑PCR試劑、某試劑Southern blot試劑、某試劑葡萄糖、某試劑蛋白胨、某試劑酵母粉、某試劑KH2PO4、某試劑MgSO4·7H2O、某試劑醋酸鈉、某試劑玉米漿

• 儀器：威尼德電穿孔轉化儀、某品牌PCR儀、某品牌凝膠成像系統、某品牌搖床、某品牌發酵罐

2. 實驗方法

2.1 基因敲除

1. pdcl基因敲除：設計pdcl基因的敲除片段（P1K），通過電穿孔轉化法將敲除片段轉化到釀酒酵母S. cerevisiae Y2中，在含G418抗性的YEPD平板上篩選轉化子。通過PCR和Southern blot驗證得到pdcl基因的敲除菌株S. cerevisiae Y2-1。

2. pdc5基因敲除：設計pdc5基因的敲除片段（P5H），通過醋酸鋰轉化法將敲除片段轉化到S. cerevisiae Y2-1中，在YNBG平板上篩選轉化子。通過PCR和Southern blot驗證得到pdcl和pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15。

2.2 發酵條件優化

1. 種子培養基：葡萄糖30g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，醋酸鈉2g/L，玉米漿0.5%，pH 5.6。

2. 發酵培養基：葡萄糖80g/L，蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，醋酸鈉2.5g/L，玉米漿1%，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，金屬離子母液5mL，pH 5.6。

3. 發酵條件：種齡26h，接種量12%，裝液量70mL/250mL三角瓶。

2.3 丙酮酸測定

采用高效液相色譜法測定發酵液中丙酮酸的濃度。

實驗結果

1. 基因敲除結果

通過PCR和Southern blot驗證，成功得到了pdcl基因敲除菌株S. cerevisiae Y2-1和pdcl、pdc5基因都缺失的菌株S. cerevisiae Y2-15。

2. 發酵條件優化結果

優化后的發酵條件下，S. cerevisiae Y2-15的丙酮酸積累量顯著提高。與優化前相比，丙酮酸的積累量從9.25g/L提高到24.85g/L，提高了168%。

討論

1. 基因敲除對丙酮酸積累的影響

PDC基因是釀酒酵母中催化丙酮酸轉化為乙醛的關鍵酶基因。通過敲除PDC基因，阻斷了乙醇生成途徑，使代謝流更多地流向丙酮酸。本研究中，首先敲除了pdcl基因，得到S. cerevisiae Y2-1菌株，在此基礎上進一步敲除了pdc5基因，得到S. cerevisiae Y2-15菌株。實驗結果顯示，敲除兩個PDC基因后，丙酮酸的積累量顯著提高，說明基因敲除策略是有效的。

2. 發酵條件優化對丙酮酸積累的影響

發酵條件對微生物代謝產物的積累具有重要影響。本研究通過優化種子培養基、發酵培養基和發酵條件，顯著提高了S. cerevisiae Y2-15菌株的丙酮酸積累量。優化后的種子培養基和發酵培養基提供了適宜的營養物質比例和濃度，有利于菌體的生長和代謝產物的積累。優化后的發酵條件，如種齡、接種量和裝液量，有利于氧氣的傳遞和菌體的代謝活動，從而提高了丙酮酸的積累量。

3. 研究的創新與應用前景

本研究通過定向改造釀酒酵母，敲除PDC基因，并通過發酵條件優化，顯著提高了丙酮酸的積累量。這種策略不僅解決了光滑球擬酵母的安全性問題，還為丙酮酸的工業化生產提供了新的思路。釀酒酵母作為一種的安全菌，在食品工業和酒精生產中有著廣泛應用，因此，改造后的釀酒酵母菌株具有廣闊的應用前景。此外，本研究中的基因敲除和發酵條件優化策略也可以為其他微生物代謝產物的生產提供借鑒。

丙酮酸作為一種重要的有機酸，在化工、農藥、農用化學品及生物制藥等領域有著廣泛的應用。隨著生物技術的不斷發展，微生物發酵法生產丙酮酸將成為未來的主要趨勢。本研究通過定向改造釀酒酵母，提高了丙酮酸的積累量，為丙酮酸的工業化生產提供了新的策略，具有重要的理論和實踐意義。

結論

本研究通過定向改造釀酒酵母，敲除PDC基因，并通過發酵條件優化，顯著提高了丙酮酸的積累量。實驗結果顯示，優化后的釀酒酵母菌株丙酮酸積累量提高了168%。這種策略不僅解決了光滑球擬酵母的安全性問題，還為丙酮酸的工業化生產提供了新的思路。改造后的釀酒酵母菌株具有廣闊的應用前景，為丙酮酸的生產和應用提供了新的策略。本研究為其他微生物代謝產物的生產提供了借鑒，具有重要的理論和實踐意義。

通過上述研究，我們不僅提高了釀酒酵母中丙酮酸的積累量，還為丙酮酸的工業化生產提供了新的策略。未來，我們將繼續深入研究釀酒酵母的代謝調控機制，進一步優化發酵條件，提高丙酮酸的產量和質量，為丙酮酸的應用提供更廣闊的空間。