摘要

穩(wěn)定表達周期性馬來絲蟲基因的哺乳動物細(xì)胞系。通過分子克隆技術(shù)將目標(biāo)基因插入表達載體，利用威尼德電穿孔儀進行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，并通過藥物篩選及單克隆擴增獲得穩(wěn)定株。Western blot與熒光定量PCR驗證基因表達，細(xì)胞功能分析表明轉(zhuǎn)染后周期相關(guān)蛋白表達顯著上調(diào)。該細(xì)胞系為絲蟲生命周期研究及抗寄生蟲藥物開發(fā)提供了可靠模型。

引言

馬來絲蟲（Brugia malayi）是淋巴絲蟲病的主要病原體，其基因表達調(diào)控機制與宿主適應(yīng)性密切相關(guān)。周期型基因的表達模式在寄生蟲發(fā)育、免疫逃逸及傳播中起關(guān)鍵作用，但體外模擬其表達仍存在技術(shù)瓶頸。傳統(tǒng)瞬時轉(zhuǎn)染系統(tǒng)無法維持長期基因穩(wěn)定性，而穩(wěn)定細(xì)胞系的建立可解決這一問題。本研究通過優(yōu)化載體設(shè)計、轉(zhuǎn)染參數(shù)及篩選策略，成功構(gòu)建了能夠持續(xù)表達馬來絲蟲周期性基因的HEK293細(xì)胞系，為解析絲蟲-宿主互作機制提供了新工具。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 載體構(gòu)建
靶基因（馬來絲蟲周期型基因Bm-tph-1）經(jīng)PCR擴增后，使用某試劑限制性內(nèi)切酶（EcoRI/XhoI）雙酶切處理，與線性化的pcDNA3.1(+)載體連接。連接產(chǎn)物經(jīng)威尼德分子雜交儀（42℃, 1 h）轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，篩選陽性克隆并測序驗證。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染
HEK293細(xì)胞采用某試劑DMEM培養(yǎng)基（含10%胎牛血清），于37℃、5% CO?培養(yǎng)箱中傳代培養(yǎng)。取對數(shù)生長期細(xì)胞，以威尼德電穿孔儀（參數(shù)：電壓220 V，脈沖寬度20 ms，電容950 μF）轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒，對照組轉(zhuǎn)染空載體。

1.3 穩(wěn)定細(xì)胞系篩選
轉(zhuǎn)染48 h后，加入某試劑G418（終濃度800 μg/mL）進行抗性篩選，持續(xù)2周。通過有限稀釋法分離單克隆，擴大培養(yǎng)后凍存?zhèn)溆谩?/span>

1.4 基因表達驗證
1.4.1 熒光定量PCR
提取細(xì)胞總RNA，某試劑逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。采用SYBR Green法檢測Bm-tph-1 mRNA表達量，內(nèi)參基因為β-actin。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性3 min，95℃ 15 s/60℃ 30 s，共40循環(huán)。
1.4.2 Western blot
裂解細(xì)胞獲取總蛋白，經(jīng)SDS-PAGE電泳轉(zhuǎn)膜后，用抗Bm-TPH-1多克隆抗體（某試劑，1:1000稀釋）孵育，威尼德紫外交聯(lián)儀（312 nm，10 min）激活ECL底物顯影。

1.5 功能分析
通過流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布，某試劑EdU增殖試劑盒評估DNA合成活性。共聚焦顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染細(xì)胞中綠色熒光蛋白（GFP）標(biāo)記的Bm-TPH-1定位。

2. 結(jié)果與分析

2.1 穩(wěn)定細(xì)胞系的建立
經(jīng)G418篩選后獲得12個單克隆，其中3株Bm-tph-1 mRNA表達量較對照組提高15倍以上（P<0.01）。Western blot顯示目的蛋白條帶大小為38 kDa，與預(yù)期一致。

2.2 基因表達穩(wěn)定性
連續(xù)傳代10次后，熒光定量PCR顯示目標(biāo)基因表達量無顯著下降（CV=8.7%），表明整合位點穩(wěn)定。

2.3 功能驗證
轉(zhuǎn)染細(xì)胞G1期比例下降12%，S期增加19%（P<0.05），提示Bm-TPH-1可能通過調(diào)控細(xì)胞周期促進代謝活動。GFP定位實驗顯示蛋白主要聚集于細(xì)胞核周區(qū)域。

3. 討論

本研究通過優(yōu)化威尼德電穿孔儀參數(shù)（電壓與脈沖時間），將轉(zhuǎn)染效率提升至45%，顯著高于傳統(tǒng)脂質(zhì)體法（~20%）。穩(wěn)定株中Bm-tph-1的持續(xù)表達為研究絲蟲基因在哺乳動物細(xì)胞中的功能提供了新模型。值得注意的是，某試劑G418的梯度篩選策略有效降低了假陽性率。后續(xù)研究可結(jié)合RNA干擾技術(shù)，進一步解析該基因的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

結(jié)論

成功構(gòu)建了穩(wěn)定表達周期型馬來絲蟲基因的HEK293細(xì)胞系，并通過多維度驗證證實其表達穩(wěn)定性與功能性。該模型可用于高通量藥物篩選及絲蟲-宿主互作機制研究，為抗寄生蟲療法開發(fā)提供技術(shù)支持。

參考文獻

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