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誠信經營質量保障價格合理服務完善分子克隆技術成功構建真核表達載體pSecTagEGFP，并利用威尼德電穿孔儀實現其在雞胚成纖維細胞中的高效轉染。實驗驗證了載體完整性及EGFP蛋白表達效率，Western blot檢測顯示目的蛋白特異性表達。該研究為基因功能分析與蛋白表達調控提供了可靠工具。
真核表達載體是基因功能研究與重組蛋白生產的核心工具，其設計需兼顧表達效率與穩定性。pSecTag載體系統因攜帶分泌信號肽及多克隆位點，廣泛應用于分泌型蛋白研究。增強型綠色熒光蛋白（EGFP）作為可視化標記，可實時追蹤基因表達動態。雞胚成纖維細胞（CEF）作為經典細胞模型，具有增殖快、轉染效率高等優勢，但其轉染條件優化仍具挑戰。
pSecTag為基礎骨架，插入EGFP基因，構建pSecTagEGFP重組載體，并系統優化CEF細胞的電轉染參數，結合威尼德電穿孔儀的高效脈沖技術，旨在建立一種穩定、高效的基因遞送體系，為后續基因編輯與蛋白分泌機制研究奠定基礎。
質粒提取與酶切：提取pSecTag2B母本質粒，采用XhoⅠ和EcoRⅠ（某試劑）雙酶切，37℃反應3小時，威尼德紫外交聯儀（0.12 J/cm2）回收線性化載體。
EGFP片段擴增：以pEGFP-N1為模板，設計含XhoⅠ/EcoRⅠ酶切位點的引物，通過高保真PCR擴增EGFP片段（反應體系：某試劑）。
連接與轉化：將酶切純化的載體與EGFP片段按3:1摩爾比混合，使用T4 DNA連接酶（某試劑）16℃連接12小時，轉化至DH5α感受態細胞，涂布于含氨芐青霉素的LB平板。
菌落PCR鑒定：隨機挑取單菌落，以載體特異性引物擴增，1%瓊脂糖凝膠電泳驗證插入片段大小。
測序驗證：選取PCR陽性克隆送測序，比對EGFP序列一致性。
CEF細胞制備：取9日齡SPF雞胚，機械分離心臟組織，0.25%胰酶（某試劑）消化后，以DMEM培養基（含10%胎牛血清）傳代培養。
電轉染優化：取第3代CEF細胞，調整密度至1×10? cells/mL，與10 μg pSecTagEGFP質粒混合，采用威尼德電穿孔儀（參數：電壓200 V，脈寬10 ms，單脈沖），轉染后立即加入預溫培養基，37℃培養48小時。
熒光顯微鏡觀察：轉染后24/48小時，威尼德倒置熒光顯微鏡下觀察EGFP綠色熒光信號，計算轉染效率（陽性細胞數/總細胞數×100%）。
Western blot分析：裂解細胞提取總蛋白，SDS-PAGE電泳后轉膜，抗EGFP一抗（某試劑）及HRP標記二抗（某試劑）孵育，ECL顯色檢測。
酶切及測序結果顯示，pSecTagEGFP載體大小為6.8 kb，EGFP基因正確插入多克隆位點。菌落PCR擴增產物與預期650 bp條帶一致，測序比對無誤。
威尼德電穿孔儀參數優化表明，200 V電壓下CEF細胞存活率達85%，EGFP表達陽性率約42%，顯著高于脂質體法（15%）。熒光信號于轉染后24小時顯著增強，48小時達峰值。
Western blot在27 kDa處可見特異性條帶，與EGFP理論分子量一致，證實載體在CEF細胞中成功表達功能性蛋白。
優化電轉染條件，顯著提升CEF細胞轉染效率。威尼德電穿孔儀的高效脈沖參數在保證細胞存活的同時，促進質粒跨膜遞送，較傳統方法更具優勢。pSecTagEGFP載體可實現分泌型蛋白與EGFP的融合表達，適用于活細胞動態追蹤及蛋白分泌途徑研究。
成功構建pSecTagEGFP真核表達載體，并建立基于威尼德電穿孔儀的CEF細胞高效轉染體系。該體系為基因功能研究與重組蛋白生產提供了技術支撐，具有廣泛的應用潛力。
1. pSecTag-EGFP真核表達載體的構建及其轉染雞胚胎成纖維細胞的研究 [J] . 朱靖 ,竇如海 ,金東慶 . 實驗動物與比較醫學 . 2008,第005期
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3. 利用同源重組構建BMP6、BMPR1B真核表達載體及共轉染成纖維細胞表達的研究 [J] . 榮恒 ,張夢瑤 ,賀建寧 . 華北農學報 . 2020,第006期
4. 利用同源重組構建Chordin、BMP6真核表達載體及共轉染成纖維細胞表達的研究 [J] . 榮恒 ,李晶 ,柳楠 . 中國畜牧雜志 . 2020,第007期
5. 利用同源重組技術構建DKK1、BMP4真核表達載體及共轉染成纖維細胞表達的研究 [J] . 張夢瑤 ,楊峰 ,劉開東 . 華北農學報 . 2018,第005期
