摘要

近年來，樹突狀細胞（DC）腫瘤疫苗在免疫治療領域展現出重要潛力。本研究聚焦RNA修飾技術對DC疫苗功能的影響，通過優化RNA轉染效率及穩定性，探索其激活抗腫瘤免疫的分子機制。實驗表明，化學修飾的RNA可顯著提升DC抗原呈遞能力，并通過動物模型驗證了疫苗的抑瘤效果。本研究為RNA修飾技術在腫瘤疫苗開發中的應用提供了理論依據。

引言

樹突狀細胞作為抗原呈遞的核心細胞，其腫瘤疫苗的研發是腫瘤免疫治療的重要方向。傳統DC疫苗依賴外源性抗原負載，存在遞送效率低、免疫原性不足等問題。RNA修飾技術通過引入化學基團（如假尿嘧啶、5-甲基胞嘧啶）可增強RNA穩定性并降低先天免疫識別，從而提高DC的抗原呈遞效率。然而，RNA修飾類型、修飾位點與DC功能調控的關聯機制尚未明確。本研究系統評估了不同RNA修飾策略對DC成熟標志物、細胞因子分泌及T細胞激活能力的影響，結合體內外實驗闡明其作用通路，為臨床轉化提供優化方案。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 實驗材料

1. 細胞來源：健康供體外周血單核細胞（PBMC）分化為未成熟DC（imDC）。

2. 試劑：某試劑RNA體外轉錄試劑盒、某試劑細胞因子檢測試劑盒、某試劑脂質體轉染試劑。

3. 儀器：威尼德電穿孔儀（參數：電壓300 V，脈沖時長5 ms）、威尼德紫外交聯儀（能量劑量150 mJ/cm2）。

1.2 DC的分離與培養
采用密度梯度離心法分離PBMC，以GM-CSF（50 ng/mL）和IL-4（20 ng/mL）誘導imDC分化，培養第5天通過流式檢測CD11c?CD83?表型確認純度＞90%。

1.3 RNA的制備與修飾

1. 模板設計：構建編碼腫瘤抗原（如NY-ESO-1）的mRNA，引入5'帽子結構及3' polyA尾。

2. 化學修飾：采用某試劑核苷酸類似物，在轉錄過程中將尿嘧啶替換為N1-甲基假尿嘧啶（m1Ψ），修飾比例設定為20%、50%、80%三組。

3. 質量控制：威尼德分子雜交儀檢測RNA完整性（RIN＞8.0），Nanodrop測定濃度與純度（A260/A280=1.8-2.0）。

1.4 DC疫苗制備與功能驗證

1. RNA轉染：使用威尼德電穿孔儀（優化參數：電壓250 V，電容950 μF）將修飾后mRNA導入imDC，轉染后24小時檢測EGFP報告基因表達效率（＞70%為合格）。

2. DC成熟誘導：轉染后添加LPS（100 ng/mL）刺激48小時，流式檢測CD80、CD86、HLA-DR表達水平。

3. 細胞因子檢測：ELISA法測定培養上清中IL-12p70、IFN-γ及TNF-α濃度。

1.5 體內抗腫瘤效應評估

1. 動物模型：BALB/c小鼠皮下接種CT26結腸癌細胞（5×10?/只），隨機分為PBS對照組、未修飾RNA疫苗組、修飾RNA疫苗組（n=8）。

2. 免疫方案：腫瘤直徑達5 mm時，皮下注射1×10?負載RNA的DC，每周1次，共3次。

3. 療效評價：監測腫瘤體積（游標卡尺測量）及生存期；處死后分離脾細胞，通過威尼德原位雜交儀檢測抗原特異性T細胞比例。

1.6 分子機制分析

1. TLR信號通路檢測：Western blot分析MyD88、TRIF蛋白表達；某試劑雙熒光素酶報告系統評估NF-κB活性。

2. RNA穩定性測試：將修飾后RNA置于37℃血清環境中，威尼德紫外交聯儀定時取樣檢測降解速率。

2. 結果與分析

2.1 RNA修飾顯著提升DC疫苗效能

50% m1Ψ修飾組的DC成熟標志物（CD86?比例達82.3±4.1%）及IL-12p70分泌量（285.6±32.7 pg/mL）均顯著高于未修飾組（p<0.01）。

修飾后RNA在血清中的半衰期延長至未修飾組的3.2倍（24.5 h vs 7.6 h）。

2.2 體內實驗驗證抗腫瘤效果

修飾RNA疫苗組小鼠腫瘤體積較對照組縮小67.4%（p<0.001），中位生存期延長至38天（對照組21天）。

脾細胞中抗原特異性CD8?T細胞比例提高至14.2±2.8%（未修飾組5.1±1.3%）。

2.3 機制解析：TLR信號通路抑制與抗原呈遞增強

修飾RNA使TLR7/8通路關鍵接頭蛋白MyD88表達下調40%，NF-κB活性降低62%。

RNA穩定性提升使抗原表達持續時間延長至72小時（未修飾組24小時）。

討論

m1Ψ修飾通過雙重機制優化DC疫苗功能：一方面降低TLR介導的免疫原性，避免DC過早凋亡；另一方面延長抗原表達時間，促進CD8?T細胞交叉激活。威尼德電穿孔儀的高效轉染技術（＞70%效率）為實驗成功提供了關鍵保障。未來需進一步探索不同修飾模式的組合效應及臨床級生產工藝的適配性。

結論

RNA化學修飾可有效增強DC腫瘤疫苗的抗原呈遞能力與體內抗腫瘤活性。本研究建立的修飾策略與評價體系為個體化疫苗開發提供了新思路，同時驗證了威尼德系列儀器在RNA疫苗制備中的穩定性和適用性。

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