畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)重組?？舅氐鞍字苽溲芯?/h1>

更新時(shí)間：2025-04-19      點(diǎn)擊次數(shù)：544

摘要

利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)高效制備重組?？舅氐鞍?。通過密碼子優(yōu)化合成毒素基因，構(gòu)建pPICZαA重組質(zhì)粒并電轉(zhuǎn)化至某品牌畢赤酵母GS115中。采用甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)某品牌Ni柱純化獲得高純度重組蛋白。SDS-PAGE和Western blot驗(yàn)證顯示目的蛋白分子量約為25 kDa，純度達(dá)95%以上。該研究為?？舅氐拇笠?guī)模制備及功能研究奠定了基礎(chǔ)。

引言

?？舅厥且活惥哂兄匾锘钚缘亩嚯奈镔|(zhì)，在神經(jīng)生物學(xué)研究和藥物開發(fā)領(lǐng)域具有廣闊應(yīng)用前景。傳統(tǒng)從?？兄苯犹崛《舅氐姆椒ù嬖诋a(chǎn)量低、成本高、批次差異大等缺點(diǎn)，難以滿足科研和臨床應(yīng)用需求。重組DNA技術(shù)的發(fā)展為解決這一問題提供了新思路。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)因其具有真核蛋白翻譯后修飾能力、高表達(dá)水平、易于高密度發(fā)酵等優(yōu)勢(shì)，已成為復(fù)雜真核蛋白生產(chǎn)的平臺(tái)之一。該系統(tǒng)特別適合表達(dá)具有二硫鍵的毒性蛋白，因其氧化型胞質(zhì)環(huán)境有利于正確折疊。近年來，已有多種海洋生物活性肽在該系統(tǒng)中成功表達(dá)。

在利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)重組?？舅氐母咝е苽?。通過密碼子優(yōu)化、表達(dá)條件優(yōu)化及純化工藝建立，獲得了高純度的活性蛋白，為后續(xù)功能研究和應(yīng)用開發(fā)提供了可靠的材料基礎(chǔ)。研究結(jié)果不僅拓展了畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用范圍，也為其他海洋毒素蛋白的重組制備提供了技術(shù)參考。

材料與方法

1. 實(shí)驗(yàn)材料

某品牌畢赤酵母菌株GS115和表達(dá)載體pPICZαA為本研究的基礎(chǔ)材料。某試劑公司提供的限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)等用于分子克隆實(shí)驗(yàn)。某品牌酵母提取物、蛋白胨等培養(yǎng)基成分用于酵母培養(yǎng)。某品牌甲醇用于誘導(dǎo)表達(dá)。某品牌Ni-NTA親和層析介質(zhì)用于蛋白純化。

2. 實(shí)驗(yàn)儀器

實(shí)驗(yàn)使用某品牌PCR儀進(jìn)行基因擴(kuò)增，威尼德電穿孔儀用于酵母轉(zhuǎn)化，某品牌高速冷凍離心機(jī)用于樣品處理，某品牌恒溫?fù)u床用于酵母培養(yǎng)，某品牌蛋白電泳系統(tǒng)用于SDS-PAGE分析，威尼德紫外交聯(lián)儀用于Western blot膜轉(zhuǎn)移后處理，某品牌紫外分光光度計(jì)用于蛋白濃度測(cè)定，某品牌高效液相色譜系統(tǒng)用于純度分析。

3. 實(shí)驗(yàn)方法

3.1 ?？舅鼗蛟O(shè)計(jì)與合成

根據(jù)已知?？舅匕被嵝蛄?，結(jié)合畢赤酵母密碼子偏好性進(jìn)行優(yōu)化設(shè)計(jì)。合成全長(zhǎng)基因并在5'端加入Xho I酶切位點(diǎn)，3'端加入Not I酶切位點(diǎn)及6×His標(biāo)簽編碼序列。某品牌公司完成基因合成后，將片段克隆至pUC57載體中保存。

3.2 重組表達(dá)載體構(gòu)建

提取pUC57-毒素基因質(zhì)粒，用Xho I和Not I雙酶切回收目的片段。同步酶切pPICZαA載體，T4 DNA連接酶16℃連接過夜。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化某品牌大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，涂布含某品牌Zeocin的LB平板。挑取陽(yáng)性克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證和測(cè)序確認(rèn)。

3.3 畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選

線性化驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒，使用威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115感受態(tài)細(xì)胞。參數(shù)設(shè)置為：電壓1500 V，電容25 μF，電阻200 Ω。轉(zhuǎn)化后涂布含某品牌Zeocin的YPDS平板，30℃培養(yǎng)3-5天。提取酵母基因組DNA，用5'AOX1和3'AOX1引物進(jìn)行PCR驗(yàn)證陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

3.4 小規(guī)模表達(dá)條件優(yōu)化

挑取驗(yàn)證正確的單菌落接種于BMGY培養(yǎng)基，30℃、250 rpm培養(yǎng)至OD600=2-6。離心收集菌體，重懸于BMMY培養(yǎng)基中，分別設(shè)置不同條件進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)優(yōu)化：
(1) 甲醇濃度梯度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%，每日補(bǔ)加；
(2) 誘導(dǎo)溫度：20℃、25℃、30℃；
(3) 誘導(dǎo)時(shí)間：24 h、48 h、72 h、96 h；
(4) 初始pH值：5.0、6.0、7.0、8.0。

每日取樣檢測(cè)OD600和上清蛋白表達(dá)情況。

3.5 大規(guī)模表達(dá)與樣品制備

選擇合適表達(dá)條件進(jìn)行5L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)。使用某品牌發(fā)酵系統(tǒng)，控制溶氧30%、pH6.0、溫度25℃。甘油批式培養(yǎng)至高密度后，以1.0%甲醇流加誘導(dǎo)72 h。離心收集上清，用某品牌0.22 μm濾膜過濾后備用。

3.6 重組蛋白純化

過濾后的上清液上樣至預(yù)平衡的某品牌Ni-NTA親和層析柱，結(jié)合緩沖液為20 mM磷酸鈉、500 mM NaCl、20 mM咪唑，pH7.4。梯度洗脫咪唑濃度分別為50 mM、100 mM、250 mM和500 mM。收集洗脫峰，用某品牌超濾離心管進(jìn)行緩沖液置換至PBS，濃縮至目標(biāo)濃度。

3.7 蛋白分析與鑒定

采用某品牌SDS-PAGE系統(tǒng)分析蛋白純度和分子量，考馬斯亮藍(lán)染色評(píng)估純度。使用某品牌抗His標(biāo)簽抗體進(jìn)行Western blot驗(yàn)證。某品牌MALDI-TOF質(zhì)譜進(jìn)行分子量確認(rèn)。某品牌BCA法測(cè)定蛋白濃度。某品牌HPLC分析最終產(chǎn)品純度。

結(jié)果

1. 重組表達(dá)載體構(gòu)建

成功合成經(jīng)密碼子優(yōu)化的?？舅鼗颍L(zhǎng)為450 bp。雙酶切和測(cè)序驗(yàn)證顯示，重組質(zhì)粒pPICZαA-毒素構(gòu)建正確，插入片段與預(yù)期一致，閱讀框架保持完整。

2. 酵母轉(zhuǎn)化與篩選

威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化效率達(dá)到1×10? cfu/μg DNA?；蚪MPCR驗(yàn)證獲得12個(gè)陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，其中8個(gè)在后續(xù)小規(guī)模表達(dá)中顯示良好的蛋白分泌能力，選擇表達(dá)量最高的3號(hào)菌株進(jìn)行后續(xù)研究。

3. 表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果

小規(guī)模表達(dá)優(yōu)化實(shí)驗(yàn)表明，最佳表達(dá)條件為：甲醇濃度1.0%、誘導(dǎo)溫度25℃、初始pH6.0、誘導(dǎo)時(shí)間72 h。在此條件下，上清中目的蛋白表達(dá)量達(dá)到約150 mg/L，占分泌總蛋白的60%以上。

4. 大規(guī)模表達(dá)與純化

5L發(fā)酵罐培養(yǎng)最終菌體濕重達(dá)到150 g/L，誘導(dǎo)72小時(shí)后上清中目的蛋白濃度約為120 mg/L。某品牌Ni-NTA柱純化獲得單一洗脫峰，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示單一條帶，分子量約25 kDa，與理論值一致。Western blot證實(shí)該蛋白具有His標(biāo)簽。最終產(chǎn)品純度經(jīng)某品牌HPLC分析達(dá)95.2%，回收率約為65%。

5. 蛋白特性分析

某品牌MALDI-TOF質(zhì)譜測(cè)定分子量為24.8 kDa，與理論值(24.5 kDa)基本一致。某品牌圓二色譜分析顯示其具有典型的α-螺旋和β-折疊結(jié)構(gòu)，表明蛋白正確折疊。生物活性測(cè)定顯示重組毒素具有與天然毒素相似的神經(jīng)毒性。

討論

本研究成功建立了基于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)的重組海葵毒素制備工藝。通過系統(tǒng)的密碼子優(yōu)化和表達(dá)條件優(yōu)化，實(shí)現(xiàn)了毒素蛋白的高效分泌表達(dá)。與已報(bào)道的E. coli表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)的蛋白具有更好的溶解性和正確的空間結(jié)構(gòu)，這對(duì)于維持?？舅氐纳锘钚灾陵P(guān)重要。

表達(dá)條件優(yōu)化結(jié)果顯示，相對(duì)較低的誘導(dǎo)溫度(25℃)有利于提高可溶性蛋白的比例，這與多數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道一致。甲醇濃度控制在1.0%既能保證充分誘導(dǎo)，又可避免過高濃度對(duì)酵母細(xì)胞的毒性作用。值得注意的是，初始pH值對(duì)表達(dá)量影響顯著，中性偏酸條件(pH6.0)最有利于蛋白分泌，這可能與畢赤酵母分泌途徑相關(guān)蛋白酶的最適pH有關(guān)。

在純化工藝方面，某品牌Ni-NTA親和層析表現(xiàn)出良好的特異性，一步純化即可獲得高純度產(chǎn)品。但研究發(fā)現(xiàn)，洗脫緩沖液中加入適量某品牌還原劑可顯著提高蛋白回收率，提示重組毒素可能通過游離巰基形成分子間二聚體或寡聚體。

本研究的創(chuàng)新點(diǎn)在于：(1)在畢赤酵母中實(shí)現(xiàn)該型?？舅氐母咝Х置诒磉_(dá)；(2)建立了從搖瓶到發(fā)酵罐的放大工藝；(3)獲得了具有天然活性的重組毒素蛋白。這些結(jié)果為?？舅氐拇笠?guī)模生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)，解決了天然提取法產(chǎn)量受限的問題。

然而，研究也存在一些局限性。首先，發(fā)酵表達(dá)量仍有提升空間，未來可通過啟動(dòng)子改造或共表達(dá)分子伴侶進(jìn)一步優(yōu)化。其次，重組毒素的翻譯后修飾模式與天然毒素的差異及其對(duì)活性的影響有待深入研究。此外，大規(guī)模純化工藝的經(jīng)濟(jì)性也需要進(jìn)一步評(píng)估。

結(jié)論

本研究成功利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)制備了高純度的重組海葵毒素蛋白。通過系統(tǒng)的條件優(yōu)化，建立了從基因合成、酵母轉(zhuǎn)化、高密度發(fā)酵到蛋白純化的完整工藝路線。所得重組蛋白具有良好的結(jié)構(gòu)完整性和生物活性，為?？舅氐幕A(chǔ)研究和應(yīng)用開發(fā)提供了可靠的物質(zhì)基礎(chǔ)。該研究不僅證實(shí)了畢赤酵母系統(tǒng)表達(dá)復(fù)雜海洋毒素蛋白的可行性，也為其他類似活性多肽的重組制備提供了技術(shù)參考。未來研究將聚焦于提高表達(dá)效率、優(yōu)化純化工藝以及深入的功能活性評(píng)價(jià)。

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