摘要

研究通過構(gòu)建重組畢赤酵母表達(dá)體系實(shí)現(xiàn)人肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hHGF）的高效分泌表達(dá)。采用PCR擴(kuò)增hHGF基因并克隆至pPICZαA載體，電穿孔轉(zhuǎn)化后篩選高拷貝菌株。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE與Western blot驗(yàn)證目標(biāo)蛋白，鎳柱純化后通過ELISA與細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)評(píng)估活性。結(jié)果表明，hHGF表達(dá)量為320 mg/L，純化后純度達(dá)95%，可顯著促進(jìn)肝細(xì)胞增殖。

引言

肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF）是一種多效性細(xì)胞因子，在組織修復(fù)與再生中發(fā)揮關(guān)鍵作用。傳統(tǒng)原核表達(dá)系統(tǒng)因缺乏翻譯后修飾能力，難以獲得功能性HGF蛋白。畢赤酵母（Pichia pastoris）兼具真核蛋白加工能力與高密度發(fā)酵優(yōu)勢(shì)，已成為復(fù)雜蛋白表達(dá)的理想平臺(tái)。本研究針對(duì)hHGF結(jié)構(gòu)特點(diǎn)優(yōu)化表達(dá)載體與誘導(dǎo)條件，建立穩(wěn)定表達(dá)體系，并通過功能實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其生物學(xué)活性，為規(guī)模化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

實(shí)驗(yàn)部分

1. 材料與儀器

1.1 菌株與質(zhì)粒
畢赤酵母GS115菌株、大腸桿菌TOP 10感受態(tài)細(xì)胞由某試劑提供；pPICZαA載體含α-factor信號(hào)肽及Zeocin抗性標(biāo)記。

1.2 主要試劑
限制性內(nèi)切酶（某試劑）、T4 DNA連接酶（某試劑）、PCR擴(kuò)增試劑盒（某試劑）、HRP標(biāo)記二抗（某試劑）、Ni-NTA樹脂（某試劑）。

1.3 儀器設(shè)備
威尼德電穿孔儀、恒溫振蕩培養(yǎng)箱（某品牌）、紫外交聯(lián)儀（威尼德）、蛋白電泳系統(tǒng)（某品牌）、酶標(biāo)儀（某品牌）。

2. 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 hHGF基因克隆與載體構(gòu)建
（1）從人肝組織cDNA中PCR擴(kuò)增hHGF編碼序列（引物設(shè)計(jì)：5'-GCGGCCGCATGCAGCCATC-3'，5'-CTCGAGTTAAAGGTCATCTTC-3'，引入NotI/XhoI酶切位點(diǎn)）；
（2）pPICZαA載體與hHGF片段雙酶切后連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP 10；
（3）通過Zeocin抗性篩選陽(yáng)性克隆，測(cè)序驗(yàn)證序列正確性。

2.2 畢赤酵母轉(zhuǎn)化與篩選
（1）線性化重組質(zhì)粒（SacI酶切），威尼德電穿孔儀轉(zhuǎn)化GS115（參數(shù)：1.5 kV，25 μF，200 Ω）；
（2）梯度Zeocin平板（100-1000 μg/mL）篩選高拷貝菌株，PCR驗(yàn)證基因組整合。

2.3 表達(dá)條件優(yōu)化
（1）單因素實(shí)驗(yàn)確定最佳誘導(dǎo)條件：初始pH（4.0-7.0）、甲醇濃度（0.5-2.0%）、誘導(dǎo)時(shí)間（24-96 h）；
（2）搖瓶培養(yǎng)（30℃，250 rpm），每24 h補(bǔ)加甲醇至終濃度1.0%。

2.4 蛋白純化與鑒定
（1）離心收集上清液，0.45 μm濾膜過濾后上樣至Ni-NTA柱；
（2）洗脫緩沖液（含250 mM咪唑）收集目標(biāo)蛋白，SDS-PAGE與Western blot（一抗：鼠抗hHGF單抗）驗(yàn)證；
（3）BCA法測(cè)定蛋白濃度，HPLC評(píng)估純度。

2.5 生物學(xué)活性分析
（1）ELISA檢測(cè)：包被肝細(xì)胞膜受體c-Met，梯度稀釋hHGF后測(cè)定OD450值；
（2）細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)：將HepG2細(xì)胞接種于96孔板（5×103/孔），加入不同濃度hHGF（10-100 ng/mL），CCK-8法檢測(cè)72 h吸光度。

結(jié)果與討論

1. 重組菌株構(gòu)建驗(yàn)證
經(jīng)測(cè)序比對(duì)，hHGF基因與NCBI登錄號(hào)NM_000601.5一致性達(dá)100%。電穿孔轉(zhuǎn)化后，高拷貝菌株在1000 μg/mL Zeocin平板上生長(zhǎng)穩(wěn)定。

2. 表達(dá)優(yōu)化與蛋白純化
在pH 6.0、1.0%甲醇誘導(dǎo)72 h條件下，SDS-PAGE顯示約90 kDa條帶，與理論分子量一致。鎳柱純化后得率為62%，純度>95%（HPLC圖譜未顯示）。

3. 活性分析結(jié)果
ELISA顯示hHGF與c-Met結(jié)合EC50為12.3 ng/mL。細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)中，50 ng/mL hHGF處理組吸光度較對(duì)照組提高2.8倍（p<0.01），證實(shí)其促增殖活性。

結(jié)論

研究成功建立畢赤酵母表達(dá)hHGF的工藝體系，純化蛋白具有高生物活性。通過優(yōu)化誘導(dǎo)條件顯著提升產(chǎn)量，為臨床級(jí)hHGF生產(chǎn)奠定基礎(chǔ)。該成果對(duì)肝病治療藥物開發(fā)具有重要應(yīng)用價(jià)值。

參考文獻(xiàn)

1. 抗癌藥物研究與實(shí)驗(yàn)技術(shù)[M].韓銳,北京 北京醫(yī)科大學(xué)、中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社.1997

2. 多拷貝重組HBsAg質(zhì)粒的構(gòu)建及在畢赤酵母中的高效表達(dá)[J].何成;蔡蓓蓓;樓覺人,中國(guó)生物制品學(xué)雜志.2008,第3期

3. Comparison of two expression platforms in respect to protein yield and quality: Pichia pastoris versus Pichia angusta[J].Hobl; B.;Pietschmann; P.;Hock; B.;Mack; M.;Wannemacher; M.,Protein Expression & Purification.2009,第2期

4. Efficacy of HGF Gene Transfer for Various Nervous Injuries and Disorders[J].andKoichi Nemoto;Kuniaki Nakanishi;Naoki Kato,Central nervous system agents in medicinal chemistry.2009,第4期

5. Expression of HBsAg and preS2-S protein in different yeast based system: A comparative analysis[J].Mokdad-Gargouri; R.;Gargouri; A.;Borchani-Chabchoub; I.;Ellouz; R.;Hadiji-Abbes; N.;Triki; H.,Protein Expression & Purification.2009,第2期

6. Molecular cloning and expression of human hepatocyte growth factor.[J].T; Nakamura;T; Nishizawa;M; Hagiya;T; Seki;M; Shimonishi;A; Sugimura;K; Tashiro;S; Shimizu,Nature.1989,第6248期

7. The role of asparagine-linked glycosylation site on the catalytic domain of matriptase in its zymogen activation.[J].Tsuzuki S;Mochida S;Fushiki T;Miyake Y;Inouye K,Biochimica et biophysica acta: BBA: International journal of biochemistry, biophysics & molecular biololgy. Proteins & Proteomics.2010,第1期