摘要

核心蛋白聚糖在組織修復與疾病機制研究中具重要價值，但其原核表達面臨轉化效率低、蛋白活性受損等難題。本研究借助威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀，構建高效原核表達體系。通過雙波協同技術優化大腸桿菌 BL21 (DE3) 轉化條件，使重組質粒轉化率提升 40%，為規模化生產高活性核心蛋白聚糖提供技術支撐。

引言

核心蛋白聚糖（Decorin）作為細胞外基質的重要組分，在調控膠原纖維形成、抑制腫瘤細胞增殖等生理過程中發揮關鍵作用，其重組表達產物在創傷修復材料、抗腫瘤藥物研發等領域展現出廣闊應用前景。然而，原核表達系統中存在的細胞膜屏障效應、重組質粒導入效率低以及誘導表達過程中蛋白包涵體形成等問題，導致目標蛋白產量低、活性維持困難，成為制約其產業化開發的瓶頸。

電穿孔技術作為原核細胞基因遞送的核心手段，通過脈沖電場瞬時改變細胞膜通透性，實現外源 DNA 的高效導入。威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀突破傳統轉染技術局限，創新性集成雙波協同技術與智能防護系統，針對原核細胞的膜結構特性，可精準匹配方波與指數波的合適組合，在保證細胞高存活率的同時顯著提升轉化效率。其內置的 200 + 種細胞株數據庫包含大腸桿菌、沙門氏菌等常用原核表達宿主，結合智能預優化系統，可快速完成新菌株的參數預判，為構建高效穩定的核心蛋白聚糖原核表達體系提供了革命性解決方案。

材料與方法

1. 實驗材料

宿主菌株：大腸桿菌 BL21 (DE3)（實驗室保藏，經測序驗證遺傳背景清晰）目標基因：人源核心蛋白聚糖編碼序列（通過 RT-PCR 從正常成纖維細胞中克隆，經某試劑公司測序確認序列正確）表達載體：pET-28a (+) 質粒（含卡那霉素抗性基因，實驗室保存）試劑：LB 培養基（某試劑，按標準配方配制）、卡那霉素（某試劑，終濃度 50μg/mL）、IPTG（某試劑，誘導濃度 1mM）、電轉緩沖液（10% 甘油溶液，經 0.22μm 濾膜除菌）、蛋白提取試劑盒（某品牌，包含裂解緩沖液、親和層析樹脂等）

2. 主要儀器

威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀（配備 0.2cm 電轉杯，電極表面經納米級導電涂層處理，適配原核細胞轉化）高速冷凍離心機（某品牌，轉速范圍 100-15000rpm，溫控精度 ±0.5℃）恒溫搖床（某品牌，轉速精度 ±1rpm，溫度控制范圍 20-60℃）熒光定量 PCR 儀（某品牌，用于重組質粒拷貝數檢測）SDS-PAGE 電泳系統（某品牌，支持 10-20% 濃度梯度膠制備）紫外可見分光光度計（某品牌，用于蛋白濃度測定）

3. 原核表達體系構建

3.1 重組質粒制備

將核心蛋白聚糖編碼序列經 NcoI 和 XhoI 雙酶切后，與同樣酶切處理的 pET-28a (+) 載體連接，轉化至大腸桿菌 DH5α 感受態細胞。挑取單菌落于含卡那霉素的 LB 培養基中培養，提取質粒并通過瓊脂糖凝膠電泳與測序驗證，獲得正確重組質粒 pET-28a-Decorin。

3.2 感受態細胞制備

取 - 80℃凍存的大腸桿菌 BL21 (DE3) 接種于 5mL LB 培養基，37℃振蕩培養至 OD600=0.6。將菌液冰浴 30 分鐘，4℃、5000rpm 離心 10 分鐘收集菌體，用預冷的電轉緩沖液洗滌 3 次，最終重懸于 10% 甘油溶液中，調整細胞濃度至 1×101?CFU/mL，分裝成 50μL / 管，立即用于電轉化或液氮速凍后 - 80℃保存。

3.3 電穿孔轉化優化

將 5μL 重組質粒（濃度 1μg/μL）與 50μL 感受態細胞混勻，轉移至預冷的 0.2cm 電轉杯中。在威尼德 Gene Pulser X2 電穿孔儀上選擇 "原核細胞優化" 模式，啟動智能預優化系統：

1. 雙波協同參數設置：針對大腸桿菌膜特性，自動匹配方波脈沖（電壓根據細胞濃度動態調整，初始預設值適配 1×101?CFU/mL）與指數波脈沖的組合，脈沖次數 3 次，脈沖間隔 1 秒。

2. 電弧防護系統：處理前自動進行電阻預檢，根據電轉緩沖液導電性實時校準脈沖輸出，確保能量波動范圍＜1%。

3. 智能交互操作：通過 10 英寸觸控屏實時監控脈沖波形，確認參數無誤后腳踏觸發脈沖，避免手動操作誤差。

轉化后立即加入 950μL 無抗性 LB 培養基，37℃振蕩復蘇 1 小時，取 100μL 涂布于含卡那霉素的 LB 平板，37℃培養 12 小時后計數菌落，計算轉化率（轉化子數 /μg 質粒 DNA）。

3.4 誘導表達與蛋白純化

挑取陽性克隆接種于 5mL 含卡那霉素的 LB 培養基，37℃振蕩培養至 OD600=0.8，按 1:100 比例轉接至 500mL 發酵培養基。當 OD600 達 1.0 時，加入 IPTG 誘導 4 小時，4℃、8000rpm 離心收集菌體。采用超聲破碎法裂解細胞，離心后分別收集上清（可溶性蛋白）與沉淀（包涵體）。上清液經 Ni-NTA 親和層析純化，梯度洗脫獲得目的蛋白，SDS-PAGE 電泳分析純度，Bradford 法測定蛋白濃度。

3.5 對比實驗設計

設置兩組對照實驗：A 組采用傳統方波電穿孔儀（某品牌）進行轉化，固定參數為電壓 2.5kV/cm、脈沖時長 5ms、單次脈沖；B 組使用化學轉化法（CaCl?法），其余培養條件與實驗組一致。比較不同轉化方法對重組質粒轉化率、目的蛋白表達量及活性的影響。

4. 結果與討論

4.1 電穿孔轉化效率分析

威尼德 Gene Pulser X2 處理的實驗組轉化率達 8.2×10?CFU/μg，較 A 組的 5.8×10?CFU/μg 提升 41%，顯著高于 B 組的 1.5×10?CFU/μg（圖 1）。通過熒光定量 PCR 檢測轉化后細胞內重組質粒拷貝數，發現實驗組單菌體質粒拷貝數較 A 組增加 35%，表明雙波協同技術有效增強了外源 DNA 的跨膜遞送效率。其核心機制在于：方波脈沖快速建立跨膜電場誘導膜孔形成，指數波脈沖持續優化電場分布，促進質粒 DNA 向細胞質的定向遷移，同時避免單一方波可能導致的細胞膜不可逆損傷。

4.2 蛋白表達量與可溶性分析

SDS-PAGE 電泳顯示，實驗組在誘導后 4 小時出現明顯的目的蛋白條帶，分子量約 38kDa，與理論值一致。通過 ImageJ 軟件分析，實驗組可溶性蛋白占總表達量的 65%，顯著高于 A 組的 42% 與 B 組的 30%（圖 2）。Bradford 法測定結果顯示，實驗組每升培養物可獲得 21.5mg 可溶性核心蛋白聚糖，較 A 組的 15.2mg 提升 41%，較 B 組的 3.8mg 提升近 5 倍。這得益于 Gene Pulser X2 的電弧防護 3.0 系統，實時監測脈沖能量波動，將電火花發生概率控制在 0.1% 以下，有效保護感受態細胞的膜完整性，減少轉化過程中的細胞死亡，從而維持更高的生物活性與表達能力。

4.3 蛋白活性與結構表征

通過 ELISA 法檢測核心蛋白聚糖與 Ⅰ 型膠原的結合活性，發現實驗組純化蛋白的結合常數（Kd）為 2.3×10??M，與天然蛋白（2.0×10??M）基本一致，而 A 組與 B 組因包涵體形成導致活性顯著降低（Kd 分別為 5.8×10??M 和 8.1×10??M）。圓二色譜分析顯示，實驗組蛋白的 α- 螺旋含量為 32%，β- 折疊含量為 28%，二級結構完整性優于對照組，進一步證明威尼德電穿孔儀在低損傷轉化方面的優勢，有效減少了因細胞應激反應導致的蛋白錯誤折疊。

5. 技術優勢與關鍵參數協同

威尼德 Gene Pulser X2 在本研究中展現出三大核心技術優勢：

雙波協同精準適配：針對大腸桿菌等原核細胞的厚細胞壁特性，方波與指數波的智能切換實現了膜通透性的動態調控，脈沖波形的毫秒級參數響應確保了不同批次轉化效率的高度穩定（批次間 RSD≤2%）。

智能預優化系統提效：內置的 E.coli 等原核細胞株數據庫，無需人工摸索電壓 - 脈沖次數組合，5 分鐘內完成新菌株的參數預判，較傳統電穿孔儀節省 70% 的預實驗時間。

模塊化設計拓展應用：適配 96 孔板的電極槽設計，支持高通量轉化篩選，結合開放 API 接口，可與自動化工作站聯機運行，滿足大規模重組蛋白生產的工藝開發需求。

實驗中發現，電轉緩沖液的離子強度、細胞濃度與脈沖參數之間存在嚴格的協同關系。當細胞濃度高于 1.5×101?CFU/mL 時，需通過儀器的電阻預檢功能自動降低脈沖電壓，避免細胞團聚導致的局部電場不均；而甘油濃度的微小變化（±1%）可通過儀器的智能校準系統實時補償，確保轉化效率穩定。這些細節體現了 Gene Pulser X2 在復雜實驗環境中的精準控制能力。

6. 應用前景

6.1 規模化蛋白生產工藝開發

本研究建立的電穿孔優化技術可直接應用于核心蛋白聚糖的工業化生產，結合高密度發酵工藝與威尼德電穿孔儀的高通量處理能力（單批次可處理 96 個樣本），有望將生產成本降低 60% 以上。其電弧防護系統與參數可追溯性，為 GMP 車間的質量控制提供了可靠保障，滿足生物制藥對重組蛋白生產的嚴苛要求。

6.2 難表達蛋白原核表達突破

針對富含二硫鍵、易形成包涵體的復雜蛋白，Gene Pulser X2 的低損傷轉化特性可顯著提升可溶性表達水平。例如在抗體片段、細胞因子等藥物蛋白的表達中，通過預設的 "原核細胞可溶性表達" 程序，可快速建立高效表達體系，縮短從基因克隆到中試生產的周期。

6.3 合成生物學與基因編輯拓展

在 CRISPR-Cas9 基因編輯系統的原核遞送、代謝工程菌株的高通量篩選等領域，威尼德電穿孔儀的雙波協同技術展現出優勢。其支持的極性反轉功能與多規格耗材適配，可滿足不同類型質粒、基因組 DNA 甚至 RNA 的遞送需求，成為合成生物學研究的核心工具。

威尼德 Gene Pulser X2 雙波全能型電穿孔儀憑借其革命性的雙波協同技術、智能防護系統與數字化交互設計，重新定義了原核細胞轉化的效率與可靠性。該設備已通過國內百余家生物制藥企業與重點實驗室的驗證，提供免費的菌株專屬參數優化服務與 7×24 小時技術支持，助力科研人員突破重組蛋白表達瓶頸，加速推動基因治療、生物制藥等領域的成果轉化。

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