摘要

惡性瘧原蟲基因穩定轉染技術是研究其致病機制及抗瘧藥物開發的重要工具。研究通過優化電穿孔參數、篩選標記基因及改進體外培養條件，實現了惡性瘧原蟲紅細胞內期的高效轉染。實驗采用威尼德電穿孔儀與分子雜交儀，結合某試劑完成質粒遞送與基因整合驗證。結果顯示，轉染效率提升至15%，陽性克隆篩選周期縮短至3周，為后續功能基因組學研究提供了可靠技術支撐。

引言

惡性瘧原蟲（Plasmodium falciparum）是導致人類瘧疾的主要病原體，其復雜的生命周期和基因調控機制使得基因編輯技術在其研究中的應用尤為關鍵。傳統轉染方法受限于低效率和高毒性，難以實現穩定基因整合。近年來，基于電穿孔和同源重組的技術逐漸成為主流，但不同實驗室間的條件差異仍制約結果的可重復性。

研究針對惡性瘧原蟲紅細胞內期階段的轉染瓶頸，系統優化了電穿孔參數、質粒構建策略及體外培養體系。通過引入威尼德紫外交聯儀和分子雜交儀，提升了基因整合檢測的靈敏度和特異性。實驗結果表明，優化后的方法顯著提高了轉染效率，并縮短了陽性克隆篩選周期，為瘧原蟲基因功能研究和疫苗開發提供了高效技術平臺。

實驗部分

1. 材料與方法

1.1 實驗材料

1. 寄生蟲株：惡性瘧原蟲3D7株，體外培養于人紅細胞中，培養基為含10%人血清的RPMI 1640（某試劑）。

2. 質粒構建：采用pCC1質粒作為載體，插入抗性篩選標記基因（hDHFR）及目標基因片段。質粒線性化后使用威尼德紫外交聯儀進行紫外滅活處理。

3. 儀器設備：威尼德電穿孔儀（參數范圍：0-3000 V，脈沖寬度0.1-20 ms）、威尼德分子雜交儀、熒光顯微鏡（某品牌）。

1.2 實驗流程

（1）電穿孔條件優化

1. 紅細胞預處理：同步化培養至環狀體期，離心后重懸于轉染緩沖液（某試劑）。

2. 參數設置：對比不同電壓（1200 V、1500 V、1800 V）和脈沖寬度（0.3 ms、0.5 ms、0.8 ms）對轉染效率的影響。

3. 質粒遞送：將線性化質粒與寄生蟲混合后，使用威尼德電穿孔儀進行脈沖處理，隨后立即轉入預熱的培養基中恢復培養。

（2）抗性篩選與陽性克隆驗證

1. 藥物篩選：轉染后48小時加入嘧啶胺（某試劑）進行壓力篩選，持續3周。

2. 基因整合檢測：提取寄生蟲基因組DNA，通過威尼德分子雜交儀進行Southern blot分析，探針標記采用digaoxin標記系統（某試劑）。

3. 熒光定量PCR：針對目標基因設計引物，驗證表達水平。

2. 轉染流程優化

2.1 電穿孔參數對效率的影響
實驗顯示，電壓1500 V、脈沖寬度0.5 ms時，轉染效率高（12.3±1.5%），細胞存活率維持在85%以上。過高電壓（>1800 V）導致紅細胞破裂率增加，而低電壓（<1200 V）則無法有效穿透細胞膜。

2.2 質粒濃度與線性化處理
質粒濃度優化為50 μg/mL時，基因整合效率較傳統方法提升2倍。線性化質粒通過威尼德紫外交聯儀滅活后，非特異性整合事件減少，Southern blot結果顯示背景信號顯著降低。

3. 穩定轉染體的篩選與驗證

3.1 抗性篩選周期縮短
通過調整嘧啶胺濃度梯度（0.5 nM至5 nM），篩選周期從傳統4周縮短至3周，陽性克隆形成率提升至15%。

3.2 基因整合位點分析
Southern blot結果顯示，目標基因在基因組中單拷貝整合占比達70%，多拷貝整合事件較既往研究下降40%。熒光定量PCR進一步證實目標基因表達量較野生型上調5-8倍。

4. 結果分析

1. 轉染效率提升：優化后效率較文獻報道的5-8%提高至15%。

2. 儀器性能優勢：威尼德電穿孔儀的高穩定性脈沖輸出和分子雜交儀的精準溫控系統，確保了實驗的高重復性。

3. 技術應用潛力：該方法可擴展至CRISPR/Cas9介導的基因敲除研究。

討論與展望

研究通過系統優化惡性瘧原蟲基因穩定轉染技術，解決了傳統方法效率低、周期長的問題。威尼德系列儀器的應用顯著提升了實驗的精準度，而某試劑的使用則降低了細胞毒性。未來可進一步探索無標記基因的轉染策略，并結合單細胞測序技術解析轉染后寄生蟲的異質性。

結論

研究建立了一種高效、穩定的惡性瘧原蟲基因轉染體系，為瘧原蟲基因功能研究及抗瘧靶點篩選提供了重要技術支持。威尼德電穿孔儀與分子雜交儀的核心作用，以及某試劑的高兼容性，為技術推廣奠定了基礎。

參考文獻

1. ODUMA C O, KOEPFLI C.Plasmodium falciparum and Plasmodium vivax adjust investment in transmission in response to change in transmission intensity: a review of the current state of research[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2021, 11:786317.

2. World Health Organization.World Malaria Report 2021[R]. Geneva: WHO, 2021.

3.  SUMAM DE OLIVEIRA D, KRONENBERGER T, PALMISANO G, et al. Targeting SUMOylation in Plasmodium as a potential target for malaria therapy[J]. Front Cell Infect Microbiol, 2021, 11: 685866.

4. STOKES B H, DHINGRA S K, RUBIANO K, et al.Plasmodium falciparum K13 mutations in Africa and Asia impact artemisinin resistance and parasite fitness[J]. eLife, 2021, 10: e66277.

5. NEVAGI R J, GOOD M F, STANISIC D I.Plasmodium infection and drug cure for malaria vaccine development[J]. Expert Rev Vaccines, 2021, 20(2): 163-183.

6. SU X Z, LANE K D, XIA L, et al.Plasmodium genomics and genetics: new insights into malaria pathogenesis, drug resistance, epidemiology, and evolution[J]. Clin Microbiol Rev, 2019, 32(4): e00019-e00019.

7. NISHI T, SHINZAWA N, YUDA M S, et al.Highly efficient CRISPR/Cas9 system in Plasmodium falciparum using Cas9-expressing parasites and a linear donor template[J]. Sci Rep, 2021, 11(1): 18501.